細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)研究的第一步。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，為了確保細(xì)胞的健康生長，實(shí)現(xiàn)下游實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，研究人員需要測定細(xì)胞生長曲線，了解其生長情況，因而在細(xì)胞培養(yǎng)過程中及實(shí)驗(yàn)前都需要用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對細(xì)胞樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，檢測活率和濃度。細(xì)胞計(jì)數(shù)的常見方法包括：手動計(jì)數(shù)及自動計(jì)數(shù)。本文將為您詳述這兩種計(jì)數(shù)方法，并對其進(jìn)行優(yōu)劣勢對比。

一.手動細(xì)胞計(jì)數(shù)

18世紀(jì)，由法國解剖學(xué)家和組織學(xué)家 Louis-Charles Malassez發(fā)明的血球計(jì)數(shù)板人工手動活細(xì)胞計(jì)數(shù)方法一直被視為細(xì)胞計(jì)數(shù)的金牌標(biāo)準(zhǔn)。

手動細(xì)胞計(jì)數(shù)操作流程：

1.收集細(xì)胞并染色

收集細(xì)胞懸液，使用準(zhǔn)備好的臺盼藍(lán)或AO/PI染料對細(xì)胞進(jìn)行染色。

2.清潔計(jì)數(shù)板

取出血球計(jì)數(shù)板，用清水沖洗表面，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。

3.蓋上蓋玻片并上樣

將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板平置于臺面上，加蓋專用的蓋玻片形成計(jì)數(shù)室，用移液器吸取細(xì)胞懸液，滴于蓋玻片邊緣，讓樣品自動緩慢滲入，一次性充滿計(jì)數(shù)室并均勻分布，防止產(chǎn)生氣泡。

4.顯微鏡觀察定位

在顯微鏡下找到合適的視野，對細(xì)胞樣品進(jìn)行觀察，通過調(diào)焦讓視野清晰，找到目標(biāo)方格。如使用AO/PI染料，應(yīng)使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)面積

5.鏡下手動計(jì)數(shù)

通過移動不同視野，重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

6.統(tǒng)計(jì)濃度并計(jì)算

根據(jù)換算公式和已經(jīng)記錄的數(shù)據(jù)，計(jì)算樣品中的細(xì)胞濃度，如果是臺盼藍(lán)染色的細(xì)胞要將活細(xì)胞和總數(shù)分開計(jì)數(shù)。

7.清潔血球計(jì)數(shù)板

同上述方法清潔血球計(jì)數(shù)板后留作下次使用。

應(yīng)用范圍：

低通量/頻率細(xì)胞計(jì)數(shù)

注意事項(xiàng)：

1、不完全清潔的血球計(jì)數(shù)板可能會導(dǎo)致生物安全問題

2、由于血球計(jì)數(shù)板的材質(zhì)問題，表面易造成劃痕嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3、雜質(zhì)殘留易造成細(xì)胞分布不均

4、清潔劑殘留可能會影響細(xì)胞活性

5、少量聚團(tuán)細(xì)胞按照一個細(xì)胞計(jì)數(shù)，聚團(tuán)較多的樣品需要重新吹打混勻再重新計(jì)數(shù)

6、關(guān)于壓在刻線上的細(xì)胞的計(jì)數(shù)原則要提前規(guī)定好

二.自動細(xì)胞計(jì)數(shù)

血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)雖被視為細(xì)胞計(jì)數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)自身設(shè)計(jì)及使用方法，導(dǎo)致計(jì)數(shù)存在一些固有問題。為了消除這些問題， 自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀應(yīng)運(yùn)而生。

常見的自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀有三種：分別是圖像式自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、庫爾特式自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀以及流式細(xì)胞儀。其中圖像式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀由于計(jì)數(shù)快速且原理最接近金標(biāo)準(zhǔn)的人工多次手工計(jì)數(shù)的結(jié)果，其原理通過儀器對細(xì)胞樣品的圖像識別，從而對細(xì)胞濃度和大小等參數(shù)運(yùn)用算法進(jìn)行自動快速的分析。進(jìn)而可以了解細(xì)胞的生活狀態(tài)和鑒別細(xì)胞死活，確定細(xì)胞接種濃度和數(shù)量以及了解細(xì)胞存活率和增殖度。

自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)操作流程

應(yīng)用范圍：

自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)場景搭配相應(yīng)的熒光通道進(jìn)行計(jì)數(shù)。

注意事項(xiàng)：

• 根據(jù)實(shí)際樣本進(jìn)行圈選參數(shù)設(shè)置

• 已稀釋樣品計(jì)數(shù)需提前設(shè)置預(yù)稀釋倍數(shù)

• 復(fù)雜樣品需檢查成像焦距是否設(shè)置正確，如有偏差及時微調(diào)修正

手動 VS 自動

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)對比

總結(jié)：

手動細(xì)胞計(jì)數(shù)——血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)可能造成數(shù)據(jù)誤差，且對血球計(jì)數(shù)板不規(guī)范的清洗操作可能造成生物危害。

自動細(xì)胞計(jì)數(shù)——計(jì)數(shù)精準(zhǔn)，速度更快，可以提高實(shí)驗(yàn)效率。此外可以在機(jī)器本身拓展熒光功能，應(yīng)用范圍更廣。

此外，USP-NF（美國藥典）建議至少選用兩種及以上方法對復(fù)蘇后的細(xì)胞進(jìn)行活率檢測，除了明場下臺盼藍(lán)染色外，常用AO/PI染色法在熒光光場下進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，因此帶有熒光功能的自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀則可更方便對細(xì)胞樣品進(jìn)行快速明場檢測和熒光檢測，所以使用自動化的儀器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)更加適用于目前的細(xì)胞生物學(xué)研究場景。

瑞沃德自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀

瑞沃德自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可配合多熒光通道，對懸液中的細(xì)胞進(jìn)行定量分析，并同時顯示明場及熒光圖像，清晰呈現(xiàn)計(jì)數(shù)結(jié)果及細(xì)胞形態(tài)；可實(shí)現(xiàn)9秒快速計(jì)數(shù)，省時省力。

同時為了滿足細(xì)胞治療和生物制藥的需求，C100-Pro軟件系統(tǒng)的數(shù)據(jù)管理和控制性能完全符合FDA 21 CFR Part11。適用于細(xì)胞治療、生物制藥、免疫學(xué)及疫苗開發(fā)、腫瘤研究、干細(xì)胞及代謝研究等研究領(lǐng)域的細(xì)胞分析。